Protocole détaillé pour l'iTP-Seq

Gillard, M. & Innis, C.A. (2024). iTP-Seq: a scalable profiling method to study context-dependent translational events in vitro. PROTOCOL (Version 1) available at Protocol Exchange.

Nous présentons un protocole reproductible pour l'iTP-Seq, qui réduit considérablement le temps et les efforts nécessaires à la création de bibliothèques de séquençage. Ce protocole comprend 12 étapes principales : amplification de la bibliothèque d'ADN, transcription in vitro, biotinylation de l'extrémité 5' de l'ARNm, traduction in vitro, digestion par la RNase R, rétention sur des billes recouvertes de streptavidine, ligation du linker, transcription inverse, synthèse du deuxième brin, digestion par des enzymes de restriction, amplification par PCR et ajout d'adaptateurs NGS. Le temps nécessaire pour réaliser un cycle complet d'iTP-seq est d'environ 10 jours.

L'iTP-Seq peut être utilisé pour caractériser tout processus bactérien impliquant une pause ou un blocage des ribosomes in vitro. Par exemple, nous l'avons utilisé pour caractériser l'inhibition de la traduction dépendante du contexte par l'antibiotique TcmX, ou le mécanisme d'induction de l'ermD par les antibiotiques érythromycine et télithromycine.